Ejemplo de ADN recombinante artificial en la enfermedad de Pompe y ejemplo de Ácidos Nucleicos recombinantes en la naturaleza (sin que haya intervenido la manipulación humana)

 ADN recombinante artificial en la enfermedad de Pompe

Tema: Producción de ácido α-glucosidasa humana recombinante (GAA) en cultivo celular vegetal de Arabidopsis thaliana alg3 con modificación dirigida de glicosilación para aplicación en la enfermedad de Pompe.

Objetivo: Desarrollar una fuente alternativa de GAA recombinante con un perfil de N-glicosilación enriquecido en estructuras tipo paucimannosa, las cuales favorecen la captación celular mediada por receptores de manosa en los lisosomas. Esto permite optimizar la eficacia de la terapia de reemplazo enzimático en pacientes con enfermedad de Pompe, mejorando la internalización celular y contribuyendo a la reducción de costos de producción frente a sistemas de expresión en células de mamífero.

Gen o secuencia a clonar: Se clonó la secuencia codificante completa del gen humano GAA (NM_000152), que codifica la enzima lisosomal ácido α-glucosidasa responsable de la degradación del glucógeno acumulado en la enfermedad de Pompe.

Enzimas de restricción: La construcción del ADN recombinante se realizó utilizando la enzima de restricción SpeI, generando extremos cohesivos compatibles tanto en el inserto como en el vector de expresión vegetal.

Enzima Ligasa: La ligación del fragmento génico al vector se efectuó utilizando T4 DNA ligasa (Ligation High Ver.2.0), permitiendo la formación de enlaces fosfodiéster estables entre el inserto y el plásmido.

Vector: Se utilizó el vector binario pFK1-BAR-GAA, diseñado para expresión en células vegetales y que contiene el gen BAR como marcador de resistencia a fosfinotricina para la selección de transformantes.

Célula Receptora: La célula receptora fue una línea de suspensión celular de Arabidopsis thaliana mutante alg3, deficiente en el procesamiento temprano de N-glicanos, lo que favorece la acumulación de glicanos ricos en manosa (paucimannosa).

Mecanismo de transferencia o inserción del gen:  

1.      Se amplifica el cDNA humano del gen GAA por PCR, incorporando sitios de restricción SpeI en sus extremos.

2.      El producto de PCR y el vector pFK1-BAR se digieren con SpeI para generar extremos compatibles.

3.      El fragmento GAA se inserta al vector linealizado mediante ligación (Ligation High Ver. 2.0), formando el plásmido recombinante pFK1-BAR-GAA.

4.      El plásmido se introduce en Agrobacterium tumefaciens LBA4404 por electroporación.

5.      La bacteria transformada se co-cultiva con células o callos de Arabidopsis alg3.

6.      La región T-DNA que contiene el gen GAA se transfiere al núcleo de la célula vegetal.

7.      El T-DNA se integra de forma estable en el genoma nuclear.

8.      Las células transformadas se seleccionan por resistencia a bialaphos.

9.      Las líneas positivas se expanden en cultivo líquido para producir GAA recombinante.

Métodos de identificación de clones:  Los clones transformados fueron seleccionados inicialmente en el medio de cultivo con fosfinotricina gracias al marcador BAR presente en el vector. También, la presencia del gen GAA se confirmó mediante PCR específica para el inserto. La integración estable en el genoma vegetal se verificó mediante análisis molecular adicional. La expresión de la proteína recombinante se evaluó mediante Western blot utilizando anticuerpos anti-GAA. La funcionalidad enzimática se determinó mediante ensayos de actividad α-glucosidasa, y el perfil de N-glicosilación fue analizado para confirmar la presencia predominante de estructuras tipo paucimannosa.

Confirmación de la producción de alfa glucosidasa ácida (GAA) en el cultivo de células alg3 de Arabidopsis transformadas.

Imagen obtenida de: https://www.frontiersin.org/journals/plant-science/articles/10.3389/fpls.2021.703020/full

Video obtenido de: https://www.youtube.com/watch?v=mto9rV5JOU0 

Referencias Bibliográficas:

1. Sariyatun R, Florence, Kajiura H, Ohashi T, Misaki R, Fujiyama K. Production of Human Acid-Alpha Glucosidase With a Paucimannose Structure by Glycoengineered Arabidopsis Cell Culture. Front Plant Sci [Internet]. 2021 [consultado 15 feb 2026];12:703020. Disponible en: https://doi.org/10.3389/fpls.2021.703020

Ácidos Nucleicos recombinantes en la naturaleza

La generación de ácidos nucleicos recombinantes en la naturaleza se evidencia en el Virus de la Inmunodeficiencia Humana tipo 1 (HIV-1), donde la recombinación genética ocurre de manera espontánea durante la replicación viral en células coinfectadas por distintos subtipos. Esto sucede debido a que la transcriptasa inversa puede alternar entre dos genomas virales diferentes mientras sintetiza ADN a partir del ARN, fenómeno conocido como “salto de plantilla”. Esto produce que se forme un ADN proviral híbrido con estructura en mosaico, compuesto por segmentos genéticos de distintos orígenes.

Estos genomas recombinantes dan lugar a formas recombinantes circulantes (CRFs), que se presentan de manera natural en poblaciones humanas. Este mecanismo contribuye significativamente a la diversidad genética, evolución y capacidad de adaptación del virus. Estudios genómicos recientes han confirmado esta dinámica al identificar nuevos CRFs y diversos patrones de recombinación entre subtipos en múltiples regiones del mundo.

Imagen obtenida de: https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC11421422/

Referencias Bibliográficas:

1. Oliveira RC, Martin D, de Souza JSM, Alcântara LCJ, Guimarães ML, Brites C, et al. Description of the new HIV-1 intersubtype B/C circulating recombinant form (CRF146_BC) detected in Brazil. Mem Inst Oswaldo Cruz [Internet]. 2024 [consultado 15 feb 2026];119:e230214. Disponible en: https://doi.org/10.1590/0074-02760230214